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《化验室_化验员》液相色谱入门基础知识

发布时间:2018-07-03 15:11:18 作者: 点击数:

第一部分 色谱基础知识

 

1、色谱起源

 

2、色谱定义

色谱法:利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术

流动相:携带样品流过整个系统的流体

固定相:静止不动的一相,色谱柱

 

色谱是一种分离技术.

色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量

 

3、色谱分类

1、高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

2、气相色谱 Gas Chromatography (GC)

3、薄层色谱 Thin-Layer Chromatography (TLC)

4、毛细管电泳 Capillary Electrophoresis(CE)

 

4、色谱优点

1、同时分析

2、分离性能好

3、灵敏度高 (ppm-ppb)

4、进样量小 (1-100uL)

 

HPLC vs GC

液相色谱:以液体作为流动相的色谱分离方法

1、适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析

2、流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用

 

气相色谱:以气体作为流动相的色谱分离方法

1、适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析

2、流动相只起运载样品分子的能力

 

5、HPLC分类

1、正相模式 (NP-LC)

2、反相模式 (RP-LC)

3、反相离子对色谱 (IPC) 

4、离子交换色谱 (IEC)

5、尺寸排阻色谱 (GPC / GFC)

 

反相模式 (RP)

填料:C18 (ODS)、C8 (octyl)、C4 (butyl)、苯基、TMS和氰基

 

 

相互作用力:

 

 

反相模式下流动相的选择:

优化水相(缓冲液)和有机相的比例非常重要(甲醇,乙腈和 THF 是常用的有机溶剂)

 

在有缓冲液的情况下, 缓冲液的浓度和pH值非常重要

 

增加流动相极性:

 

 

固定相极性变化对分离的影响:

 

 

固定相极性变化对分离的影响:

 

 

离子对色谱

离子对试剂

•阴离子化合物:氢氧化四丁基铵、溴化四丁基铵

•阳离子化合物:丁烷基磺酸钠(C4)、戊烷基磺酸钠(C5)、己烷基磺酸钠(C6)、庚烷基磺酸钠(C7)、辛烷基磺酸钠(C8)、癸烷基磺酸钠(C10)、十二烷基磺酸钠(SDS)

 

离子对色谱影响因素

•离子对试剂的类型

•离子对试剂的浓度

•流动相的pH

 

正相色谱

色谱柱:

•硅胶柱:常用

•氰基柱: 常用

•氨基柱: 分析糖

•二醇基柱: 分析蛋白质

 

 

 

相互作用力

 

 

氢键力

•如果样品有

–-COOH: 羧基

–-NH2: 氨基

–-OH: 羟基

则氢键力强.

 

•如果样品没有任何官能团,象碳水化合物

•如果样品有大的基团, 由于空间障碍

则氢键力弱.

 

正相模式下流动相的选择:

•主要试剂:烷烃(戊烷, 己烷, 庚烷, 辛烷)、芳香烃(苯, 甲苯, 二甲苯)、二氯甲烷–氯仿、四氯化碳

•辅助试剂:甲基-t-丁基醚(MTBE)、乙醚、四氢呋喃(THF)、二氧杂环乙烷、嘧啶、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、异丙醇、乙醇、甲醇

为了调整保留时间,可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂。

 

增加流动相极性:

 

 

反相色谱与正相色谱的对比:

反相:保留时间重复性好、固定相耐用

正相:对立体异构体有很好的分离(Vitamin E等)、保留时间重复性稍差

 

离子交换色谱:

 

 

离子交换色谱应用:

生物领域(蛋白质, 农药, 氨基酸分析)

离子分析

阳离子交换剂:强阳离子交换剂(SCX)(R-SO3-)

弱阳离子交换剂(WCX) (R-COO-)

阴离子交换剂:强阴离子交换剂(SAX) (R4N+)

弱阴离子交换剂(WAX)(DEAE)

 

尺寸排阻色谱法(SEC)

 

 

 

第二部分 柱子基本性能参数

 

1、表征色谱柱的参数

硅胶纯度:填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度。

色谱柱尺寸:填料床的长度和内径。

颗粒形状:球型或不规则型。

粒径:平均颗粒直径,通常3-10μm。

表面积:颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/g表示。

孔径:颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300Å。

碳百分率:与基体物质相连的键合相的量。

封尾:用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来。

 

2、表征色谱柱性能的参数

(1)容量因子, k'

 

 

(2)理论塔板数, N

 

 

(3)分离度, Resolution

 

 

完全分离时的分离度

 

 

(4)拖尾因子,T

 

 

 

第三部分 HPLC硬件基础知识

 

1、液相色谱简易流程图

 

 

2、流动相的选择

(1)采用“HPLC”级溶剂

(2)避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂

(3)对试样有适宜的溶解度

(4)溶剂粘度要小

(5)与检测器相匹配

 

水的等级

HPLC用水可以通过以下几个方法得到:

(1)专门的纯水机或超纯水机:理想的HPLC用水应为18.2MΩ的超纯水,并通过0.22μm的滤膜,除去热源、有机物、无机离子等。

(2)去离子水重蒸;

(3)二次或三次重蒸水;

不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水。

 

 

 

有机溶剂的等级

 

 

应选用HPLC级的有机溶剂。

 

缓冲盐

选择缓冲液的步骤:

1、确定最佳分离状态时的流动相pH

2、选择具有与流动相pH相近的pKa的缓冲液(即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液)

3、确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收(在波长210nm附近进行检测时,不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液)

 

 

 

缓冲液的使用:

(1)使用前必须过滤。

(2)使用后一定要进行清洗,以免造成腐蚀、磨损、阻塞:用含5%甲醇 的水溶液冲洗30min(1ml/min),再用甲醇冲洗30min。

(3)用纯水冲洗泵头清洗管路。

(4)易受到细菌和霉菌的影响。

 

 

流动相的更换

不互溶的流动相不能直接更换,缓冲盐不能直接用有机溶剂更换

 

 

溶剂的黏度

(1)乙腈黏度低在相同流速时有较低的柱压。

(2)当和水混合时黏度有变化柱压也相应有变化。

 

 

溶剂前处理

过滤

过滤:0.45um或更小孔径滤膜目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞色谱柱,尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。

滤膜类型:

聚四氟乙烯滤膜:适用于所有溶剂,酸和盐。

醋酸纤维滤膜:不适用于有机溶剂,特别适用于水基溶剂。

尼龙66滤膜:适用于绝大多数有机溶剂和水溶液,可以用于强酸,不适用于二甲基甲酰胺。

再生纤维素滤膜:蛋白吸收低,同样适用于水溶性样品和有机溶剂。

 

脱气

 

脱气:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡

气泡对测定的影响:

(1)泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积

(2)柱中气泡使流动相绕流,峰变形

(3)检测器中的气泡产生基线波动

 

脱气方法:

1、超声脱气

2、减压脱气

3、在线脱气

 

3、样品前处理

 

(1)使用流动相溶解样品

--减少溶剂峰,尤其是组分峰靠近溶剂峰时尤为重要

--保证样品在流动相中的溶解度,避免样品在系统中,

尤其在柱中产生沉淀

(2)进样前最好使用0.45um 的滤膜进行过滤,

如果样品很脏,要使用0.22um的滤膜进行过滤。

(3)对于含有复杂基质的样品,最好前处理后再进样。

 

4、进样

(1)进样器

•自动进样器

•手动进样器原理:(六通阀)注入方式:1)全量注入2)部分注入

 

(2)手动进样器的原理图

 

•部分注入:一般要求进样量最多为定量环体积的一半,如20μl的定量环最多进样10μl的样品,并且要求每次进样体积准确、相同。

•全量注入:进样量最少为定量环体积的3至5倍,即20μl的定量环最少进样60至100μl的样品,这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液,达到所要求的精密度及重现性。

 

5、洗脱

(1)等度洗脱

 

 

(2)梯度洗脱

 

 

使用梯度洗脱的原因:

 

 

梯度洗脱要点:

梯度洗脱:

优点:可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度

注意事项:

(1)溶剂的纯度要高,否则梯度洗脱的重现性差。

(2)梯度混合的溶剂互溶性要好。

(3)梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器(如

紫外吸收检测器或荧光检测器),而不能使用对流动相组成变

化敏感的通用型检测器(如示差折光检测器)。

(4)查看空白实验的数据。

(5)遵守分析周期(最初的分析数据不采用)。

 

6、色谱柱的类型及适用范围

 

 

7、分析柱的维护

1、在使用新柱之前,最好用强溶剂在低流量下(0.2-0.3 ml/min)冲洗30 min,长时间未用的分析柱也要同样处理。

2、定期使用强溶剂冲洗柱子。

3、使用缓冲盐时,要先用含5%甲醇的水溶液冲洗,再用有机溶剂冲洗。

4、净化样品。

5、分离条件。

6、不使用时,要盖上盖子,避免固定相干涸。

 

8、常用检测器

(1)紫外检测器(包括二极管阵列检测器)

(2)荧光检测器

(3)示差折光检测器

(4)电导检测器

(5)蒸发光散射检测器

(6)质谱检测器

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