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奥普斯分享:详细高效液相色谱法及分离条件

发布时间:2018-06-12 17:09:27 作者: 点击数:

奥普斯为你详细高效液相色谱法及分离条件:

HPLC法中分离条件的选择:

1.固定相与装柱方法的选择:

选粒径小的、分布均匀的球形固定相(dp≤10μm);

首选化学键合相,匀浆法装柱;

2.流动相及其流速的选择:

选粘度小、低流速的流动相—甲醇,1mL/min; 

3.柱温的选择:

选室温25℃左右;

各类高效液相色谱法

(一)液固吸附色谱法(LSC)

流动相为液体,固定相为固体吸附剂;

1.分离机制:

利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力差异;

分离前提:

K不等或k不等;

2.固定相:

与LC比,固定相粒径不同(<10μm);

3.流动相:

底剂(烷烃)+有机极性调节剂; 

※例:正己烷或庚烷+氯仿。。。

4.影响K的因素:

与固定相性质和流动相性质有关;

溶质分子极性↑,洗脱能力↓,k↑,tR↑;

溶剂系统极性↑,洗脱能力↑,k↓,tR↓;

注:调节溶剂极性,可以控制组分的保留时间;

5.出柱顺序:

强极性组分后出柱,弱极性组分先出柱;

6.硅胶吸水量↑,LSC→LLC

硅胶含水量较小,吸附色谱,硅胶极性较大;

硅胶含水量>17% ,分配色谱,硅胶失活→载体;

吸附的水→固定液

 

 

 

(二)液-液分配色谱法(LLC)

1.分离机制:

利用组分在两相中溶解度的差异

2.固定相:

载体+固定液(物理或机械涂渍法)

缺点:

系统内部压力大,易流失,不实用

固定液-极性→NLLC

固定液-非极性→RLLC

3.①正相色谱-固定液极性>流动相极性(NLLC)

极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱:适于分离极性组分;

②反相色谱-固定液极性<流动相极性(RLLC)

极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱:适于分离非极性组分;

(三)化学键合相色谱法(BPC)

1.化学键合相

(1)分离机制:

分配+吸附(以LLC为基础);

(2)特点:

1)不易流失;

2)热稳定性好;

3)化学性能好;

4)载样量大;

5)适于梯度洗脱;

2.反相键合相色谱

(1)分离机制:

疏溶剂理论;

正相-流动相与溶质排斥力强,作用时间↑,K↑,组分tR↑;

反相-流动相与溶质排斥力弱,作用时间↓,K↓,组分tR↓;

(2)固定相:

极性小的烷基键合相;

C8柱,C18柱(ODS柱-HPLC约80%问题);

(3)流动相:

极性大的甲醇-水或乙腈-水;

流动相极性>固定相极性;

底剂+有机调节剂(极性调节剂);

例:水+甲醇,乙腈,THF;

(4)流动相极性与k的关系:

流动相极性↑,洗脱能力↓,k↑,组分tR↑

(5)出柱顺序:

极性大的组分先出柱;

极性小的组分后出柱;

(6)适用:

非极性~中等极性组分(HPLC 80%问题)

3.正相键合相色谱

(1)分离机制:

溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力

(2)固定相:

极性大的氰基或氨基键合相;

(3)流动相:

极性小(同LSC);底剂+有机极性调节剂;

例:正己烷+氯仿-甲醇,氯仿-乙醇;

(4)流动相极性与K的关系:

流动相极性↑,洗脱能力↑,组分tR↓,k↓;

(5)出柱顺序:

结构相近组分,极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱;

(6)适用:

氰基键合相与硅胶的柱选择性相似(极性稍小),分离物质也相似;

氨基键合相与硅胶性质差别大,碱性,分析极性大物质、糖类等;

4.离子对色谱和离子抑制色谱

反相离子对色谱法(IPC或PIC)

反相色谱中,在极性流动相中加入离子对试剂,使被测组分与其中的反离子形成中性离子对,增加K和tR,以改善分离;

(1)离子对试剂:

烷基磺酸钠→分析碱

四丁基季胺盐→分析酸

(2)影响K的因素:

a.与m的极性有关(同反相色谱);

b.与R的链长有关:R↑长,极性↓小,tR↑,k↑;

(3)适用:

较强的有机酸、碱;

 

反相离子抑制色谱;

 

在反相色谱中,通过加入缓冲溶液调节流动相pH值,抑制;

组分解离,增加其K和tR,以达到改善分离目的;

1)离子抑制剂:

弱酸、弱碱性物质;

pH一定的缓冲溶液;

2)K的影响因素:

与流动相极性有关,还与pH值有关;

选择流动相:

应同时考虑极性及pH值;

酸性物质-加入酸HAc,tR↑,K↑;

碱性物质-加入碱NH3·H2O,tR↑,K↑;

调节pH范围:3.0~8.0;

pH>8.0破坏键合相与载体的结合;

pH<3.0腐蚀柱子;

3)适用:

极弱酸碱物质;

pH=3~7弱酸;

pH=7~8弱碱;

两性化合物;